远慕生物阐述：免疫组化操作流程

（一） 仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴锅

（二） 试 剂
1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L,
KH2PO4 1.4mmol/L.
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA&
8226;2H2O,用10mmol/L
NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0,加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0–9.5）等量混合
b 油和TBS(PBS)配制
8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本

（三） 操作流程
1 脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2 抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：
A 抗原热修复
a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染色加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。
b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。
C 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原：
Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin.
ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法 
常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP.
Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
3 免疫组化染色
SP法
（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2-3次各5分钟 （3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在
TMA上，室温静置10分钟 （4）PBS洗2-3次各5分钟 （5）抗原修复
（6）PBS洗2-3次各5分钟 （7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（8）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟（10）PBS洗3次每次2分钟
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl,室温静置或37℃1小时（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的
tween-20.(13)PBS洗3次各5分钟(14)DAB显色5-10分钟，在显微镜下掌握染色程度 （15）PBS或自来水冲洗10分钟 （16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化（17）自来水冲洗10-15分钟 （18）脱水、透明、封片、镜检。
SABC法
（1） 脱蜡、水化 （2）PBS洗2次各5分钟 （3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次（4）抗原修复
（5） PBS洗5分钟 （6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体（7）滴加Ι抗50μl,室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（8）PBS洗3次各2分钟（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
（10）PBS洗3次各2分钟 （11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
(12) PBS洗4次各5分钟 (13) DAB显色：试剂盒或自配显色剂显色
（14）脱水、透明、封片、镜检。