产品说明
本比色分析试剂盒是基于孔雀绿、钼酸盐和自由磷酸根离子形成绿色复合物测定自由磷酸根离子含量。该反应快速、灵敏、可用分光光度计(600 – 660nm)或酶标仪方便地测量。试剂适用于试管、比色皿或多孔板(96或384孔板)。
产品特点
试剂稳定性高：由于我们的创新配方，试剂没有沉淀析出，因此测试前不需预先过滤试剂。
高灵敏性：检测范围0.02 - 40 mM 磷酸根。
快速和方便：均相法只需混合和测量，20分钟内量可完成检测。
兼容性高：试剂适用于试管、比色皿、96或384多孔板，分光光度仪或酶标仪上读数。
重复性高：在96/384孔板上Z’因子为0.7-0.9，易于自动化作高通量药物筛选。
产品用途
磷酸酶检测：从肽、蛋白质或小分子底物中释放的磷酸磷酸根离子。
脂肪酶检测：从磷脂中释放的磷酸根离子。
核苷三磷酸酶检测：从核苷三磷酸(ATP, GTP, TTP, CTP等)中释放的磷酸根离子。
磷酸根定量测定：存在于磷脂、蛋白质和DNA等物质中的磷酸根。
药物开发：高通量筛选磷酸酶抑制剂。
试剂盒组成：用96孔板可做2500次测试
试剂A：50 mL     试剂B：1 mL   标准液：1 mL 1 mM磷酸盐
储藏条件：4°C下保存，保质期一年。
预防措施：本产品仅供研究用。使用过程中严格遵循实验安全措施。
96孔板法测试步骤
制备足够量的工作试剂：将试剂放置至室温。 混合100 vol试剂A和1 vol 试剂B(如：5 mL试剂A和50 mL试剂B)。每个检测需20mL工作试剂。工作试剂可在常温下保存一天。
注意：检测前，确保所有酶和缓冲液不含磷酸盐。将20mL工作试剂与80mL酶/缓冲液混合，620nm处OD值应该低于0.2；如果OD值超过0.2，则水或所用试剂中可能含过量的磷酸盐。
1、磷酸根标准：混合40µL 1mM的标准液和960µL蒸馏水得到40 µM的磷酸盐标准液。按照下表稀释标准液，转移80mL标准液到平底透明的96孔板的不同孔中。
No
Premix + H2O
Final Vol     (mL)
Phosphate
Conc (mM)
pmoles Phosphate
in 50 mL
1
200mL +   0mL
200
40
2,000
2
160mL +  40mL
200
32
1,600
3
120mL +  80mL
200
24
1,200
4
  mL + 120mL
200
16
  800
5
  60mL + 140mL
200
12
  600
6
  40mL + 160mL
200
  8
  400
7
  20mL + 180mL
200
  4
  200
8
    0mL+200mL
200
  0
     0
2、转移80mL样品到平, 板的不同孔中。
注意：对ATP酶/GTP酶反应，ATP和GTP的浓度应< 0.25mM。如果ATP或GTP浓度>0.25mM，用蒸馏水稀释(比如，ATP酶反应物含有1 mM ATP，检测前加入4倍的水稀释反应混合物)。
3、在每个孔中加入20µL工作试剂。轻敲平板将试剂混合均匀。注意：工作试剂会终止酶反应。
4、在室温下反应30分钟，颜色变深。
5、记录600-660nm (620nm)吸光值。
注意事项
比色皿检测：步骤和96孔板检测步骤一样。不同的是，标准液和样品的量是800µL，工作试剂200µL。
384孔板检测：标准液和样品的量是40µL，工作试剂10µL。
沉淀：磷酸盐浓度很高(>100 mM) 或蛋白质和金属含量高时会发生沉淀。如果出现沉淀，用水稀释样品，直到不会出现沉淀，用稀释的样品重复测试，结果乘以稀释倍数。
酶反应：由于任何外来的磷酸盐会干扰测试，确保酶准备过程中和缓冲液所用试剂不含磷酸盐。
液体处理：检测混合液含有0.4M硫酸，可用等量的NaOH中和废液。
数据分析
绘制标准曲线，通过标准曲线测定样品中磷酸盐的浓度。
论文发表
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3. Saran, D. et al (2006). Multiple-turnover thio-ATP hydrolase and phospho-enzyme intermediate formation activities catalyzed by an RNA enzyme. Nucleic Acids Research, 34(11): 3201–3208.
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