RNA pull-down简介
RNA pull-down 是检测RNA结合蛋白与其靶RNA之间相互作用的主要技术手段之一，是近年来研究IncRNA，circRNA跟蛋白相互作用的主要手段。随着基因时代的来临，RNA相关研究成为生物学的重要内容。在肿瘤，慢性疾病如糖尿病，肠炎等领域得到广泛研究，但是其相关机制研究仍知之甚少，各种新发现的IncRNA，circRNA与蛋白的互相作用有待进一步去研究发现。
案例解析
如何设计和应用RNA pull-down，为我们的实验添分加彩呢？下面以一篇典型lncRNA的文章为例。
结直肠癌是全球第三大常见癌症类型，也是全球癌症死亡的第四大原因之一。尽管在早期发现和干预方面的技术进步已经部分地改善了结直肠癌的总体存活率，但鉴于复发和转移的频率很高，对于晚期结直肠癌患者的预后仍然很差。因此，研究结肠癌肿瘤发生和发展的深层分子机制仍然紧迫。2018年9月28在Molecular Cancer一篇文章The long noncoding RNA SNHG1 regulates colorectal cancercell growth through interactions with EZH2 and miR-154-5p给我们提供了典型的研究思路。文章中通过数据库对比发现结肠癌IncRNA SNHG1异常表达，结合生物信息学，RNA荧光原位杂交，荧光素酶报告基因，RNA pull-down探索SNHG1的作用机制，结果表明SNHG1可直接与PRC2互相作用，调节细胞核中KLF2和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂2B启动子和组蛋白甲基化。在细胞质中，SNHG1充当miR-154-5p的海绵，降低其抑制细胞周期蛋白D2（CCND2）表达的能力, SNHG1可以作为结肠直肠癌诊断和治疗的潜在靶标。
确定研究的目标IncRNA
首先作者通过数据库对比发现lncRNA SNHG1在人结肠癌中上调，为了确保查询结果的可靠性，作者通过GEO芯片数据,都发现SNHG1在肠癌中明显上调，并且在80对结肠癌患者癌组织和毗邻组织中也得到相同的结果。当然，作者的前期调研工作还没有结束。为了研究SNHG1与临床病例特性的关系，通过对比发现SNHG1水平与肿瘤侵袭，迁移有关，另外调研SNHG1的高表达会降低肠癌患者的生存率，一系列的数据库分析结果都表明SNHG1在肠癌发生发展中起重要的作用（借助数据库寻找目标基因是目前常用手段）。那么在人类肠癌细胞中表达如何呢？结果发现在人结肠癌细胞HCT-29，DLD-1，SW-620，HCT-8和sw-480中都有上调。由此进一步证实SNHG1在结肠癌发病预后等过程中起重要的作用。通过上面这一系列的调研分析，作者确定了研究目标靶基因SNHG1，故事正式开始。
lncRNA SNHG1如何被激活
如何去解析这个故事呢？是搔首踟蹰还是埋头苦思，亦或是胡乱猜测SNHG1对结肠癌以及结肠癌细胞的影响呢？当然不是，聪明的作者依然是选择站在巨人的肩膀上看的更高更远。作者再次利用数据库去寻找SNHG1上面的转录因子结合位点，发现SP1得到很高的评分，SP1在SNHG1启动子区域大量富集。由此锁定SP1与SNHG1在肠癌中的转录有关，进而作者在HCT-116和HCT-8细胞中敲除SP1，SNHG1的表达也降低，SP1过表达促进SNHG1的表达，同时通过CHIP证明SP1直接结合在SNHG1的启动子位置。
SNHG1对结肠肿瘤以及结肠癌细胞的影响
确定的研究目标，也知道了SNHG1如何被激活，后面故事进入了常规，通过动物体内实验和细胞体外实验研究SNHG1在体内具有促进肿瘤生长的作用，在体外促进结肠癌细胞的增殖和调节自噬。
亮点解析
那么，作者的研究就此结束？当然不能，一篇缺少功能机制分析的实验或文章，不是完整严谨的设计。接下来对SNHG1作用机制分析才是最为关键的，这才是故事的升华。功能机制离不开蛋白表达和作用，必然要设计RNA与蛋白的相互作用分析，必然用到RNA pull-down 技术。
一个lncRNA的功能依赖于他的亚细胞分布，所以作者通过FISH和亚细胞分离，确定了SNHG1的分布，然后通过预测和双荧光素酶鉴定SNHG1与miR-154-5p结合。RNA免疫沉淀（RIP）测定结果显示SNHG1和miR-154-5p在含有AGO2的微核糖核蛋白复合物中显着富集，表明AGO2蛋白在结直肠癌细胞中直接结合SNHG1和miR-154-5p。进一步再用RNA pull-down分析也证实SNHG1可直接与结直肠癌细胞中的AGO2结合。
作者在此处分别用RIP和RNA pull-down 从蛋白角度和RNA角度验证了RNA与蛋白的相互作用，极具说服性。
有人说，既然作者已经用RIP进行了验证，没必要再用RNA pull-down？
其实不然，虽然RIP和RNA pull-Down 都是研究RNA和蛋白互相作用的经典方法，但是二者的出发点不同，RIP 是从已知的蛋白角度出发，研究与未知RNA互相作用的技术。用蛋白抗体做免疫沉淀，把蛋白结合的RNA富集出来并鉴定，以证实蛋白与RNA互相作用。而RNA pull-down 是用已知的RNA去拉蛋白，再用Western Blot 验证以证实蛋白与RNA相互作用的技术。因此二者是分别从不同的角度去验证，当两个实验都是阳性结果，才能说明二者之间确实从在的互相作用，实验更加严谨，更具说服力。
锐赛RNA pull-down服务
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参考文献：
Xu M, Chen X, Lin K, et al. The long noncoding RNA SNHG1 regulates colorectal cancer cell growth through interactions with EZH2 and miR-154-5p.Molecular Cancer. 2018;17:141. doi:10.1186/s12943-018-0894-x.
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